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BERTHO Gildas

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Ingénieur de Recherches - CNRS

Équipe de RMN et Modélisation Moléculaire, Université Paris Descartes

Responsable de la plateforme RMN

Plate-forme de RMN, Université Paris Descartes

Coordonnées

1er Etage - Porte R176

Téléphone : +33 (0)1 42 86 21 82

Contact : gildas.bertho@parisdescartes.fr

Parcours de recherche

La résonance magnétique nucléaire (RMN) offre la possibilité d’observer en 3D les molécules bioactives dans un environnement proche de conditions physiologiques et regarder leur interaction avec une cible thérapeutique. Pendant mon cursus de biochimiste, j’ai découvert les aspects techniques de la RMN à travers un stage volontaire de niveau M1 avec le Professeur Marius PTAK, au Centre de Biophysique Moléculaire d’Orléans. Je me suis orienté ensuite vers la biophysique moléculaire pour essayer de mieux apprécier l’outil RMN, capable de déterminer les structures 3D de composés d’intérêt biologique en solution. Pour réaliser mon stage de DEA puis ma thèse de Doctorat de Biophysique Moléculaire de l’Université Pierre et Marie Curie (1998), le Professeur Jean-Pierre GIRAULT m’a accueilli dans son équipe de RMN et de Modélisation moléculaire du Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques (LCBPT) dirigé actuellement par le Docteur Isabelle ARTAUD à l’Université Paris Descartes. On m’a confié la mise au point de l’expérience de NOEs transférés (TRNOEs) pour l’étude par RMN et Modélisation Moléculaire de l’interaction d’antibiotiques macrolides avec un édifice géant comme le ribosome bactérien. L’expérience TRNOEs permet, si les conditions de cinétique et de relaxation sont réunies, de déterminer la structure 3D des antibiotiques macrolides liés au ribosome. Durant ma thèse, je me suis aperçu que la RMN pouvait être un outil formidable d’étude des interactions ligands-récepteur au niveau moléculaire et que ces interactions sont liées à l’activité biologique. Avec une masse moléculaire d’environ 2.5 millions de Dalton, le ribosome représente une des enzymes les plus grandes et complexes de la cellule. Dans ces conditions, le rapport (R) optimal de molécule Ligand/récepteur utilisé qui permet d’avoir des informations sur la structure liée de l’antibiotique devient exceptionnel (R=5000). La France -qui est un des pays les plus grands consommateurs d’antibiotiques- compte le plus grand nombre d’échecs thérapeutiques contre des pneumocoques totalement résistants à la pénicilline. La résistance aux antibiotiques est un problème de santé publique. Le pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) a développé une résistance imposant des doses plus élevées d’antibiotique. En 2000, on comptait environ 50% de souches résistantes, en particulier dans les grandes villes. Les staphylocoques méthicilline-résistants, particulièrement redoutables, sont insensibles aux pénicillines. Les infections à staphylocoque méthi-R sont typiquement des infections nosocomiales sévères, responsables d’une lourde mortalité. Plus d’un tiers des affections au staphylocoque doré sont désormais impossibles à traiter avec les antibiotiques. Il est probable que les 3/4 des 4 200 décès pour infections nosocomiales soit le fait de bactéries multirésistantes aux antibiotiques. Par le biais de la société pharmaceutique Roussel-Uclaf, qui a financé ma thèse, j’ai eu la chance de travailler sur des composés tête de série "lead", des antibiotiques macrolides de troisième génération les "kétolides", et d’aller préparer sur place, à Romainville, les ribosomes nécessaires pour l’étude. Depuis, le kétolide HMR8647 plus connu maintenant sous le nom de ketek® (http://www.ketek.com) est commercialisé par le groupe Sanofi-Aventis. En dernière année de thèse, j’ai montré qu’il est possible par RMN de (i) détecter dans un mélange les ligands d’un récepteur macromoléculaire, (ii) distinguer le meilleur ligand et (iii) d’identifier les zones du ligand impliquées dans l’interaction. En 1998, à mon entrée au CNRS, la responsabilité du service commun de RMN de l’UMR8601 m’a été confiée. J’ai participé pour la première fois à l’encadrement d’un étudiant en thèse (Laurent VERDIER) avec l’aide du Docteur Josyane GHARBI-BENAROUS et du Professeur Jean-Pierre GIRAULT. Depuis, j’ai participé à l’encadrement des étudiants thésards du groupe.

Avec Laurent VERDIER, j’ai mis au point des méthodes RMN, pour déterminer l’affinité des antibiotiques pour le ribosome bactérien : (1) L’analyse des largeurs de raies permet d’apporter une première réponse. (2) L’élargissement de raies étant proportionnel à la valeur de relaxation T2, la mesure des valeurs de T2CPMG a permis aussi d’estimer l’affinité des antibiotiques par RMN. (3) Des expériences de compétitions ont permis de prouver qu’il existait un site de fixation commun aux molécules antibiotiques et d’obtenir la valeur KD/KI. De nouvelles méthodes étaient envisageables pour aller plus loin dans l’analyse. Ainsi, l’expérience 1D RMN de différence de transfert de saturation (STD) a été mise en place et appliquée avec succès à l’étude de l’interaction P-VpU/beta-TrCP pendant la thèse de Gaël COADOU (2004). Le STD est maintenant appliqué au laboratoire pour les différentes thématiques d’études d’interaction. Lors de la thèse de Simon MEGY (2005) portant sur l’étude de l’interaction P-beta-Caténine/beta-TrCP, nous avons mis en évidence que la structure RMN est cohérente avec la structure cristallographique du complexe d’un peptide P-beta-Caténine/beta-TrCP publiée au même moment.

Avec Julien PONS (Soutenance de thèse prévue en 2008) l’analyse STD est appliquée à l’étude des interactions P-ATF4/beta-TrCP et P-I_kappa-B_alpha/beta-TrCP afin de déterminer les points de contacts communs entre les peptides phosphorylé avec beta-TrCP. Des expériences plus anciennes utilisant des filtres de relaxation T2 (reverse NOE pumping) ou des filtres de diffusion de type DOSY (NOE pumping) ont été mises au point au laboratoire. Une autre méthode basée sur la diffusion de spin et le transfert de saturation par l’eau liée au récepteur (WaterLOGSY) s’avère très intéressante. J’ai ainsi acquis un savoir-faire des diverses méthodes RMN existantes et entamé une étude comparative de ces différentes méthodes. Nous sommes également en train de valider nos méthodes de mesure de constantes d’affinité par RMN (WaterLOGSY et STD), par quelques expériences utilisant la technique de Biacore (expériences réalisées à l’Institut Pasteur, Paris) et la fluorescence.

Recherches actuelles

Mon projet de recherche à moyen terme (5-10 ans) consiste à développer et mettre au point de nouvelles méthodes RMN pour l’étude des interactions macromolécule-ligand. Ce projet s’appuie sur des collaborations avec des laboratoires académiques et industriels. La RMN va certainement intervenir de façon plus efficace dans les toutes premières étapes de recherche de ligands. La stratégie envisagée repose sur les étapes suivantes : (i) l’identification de "hits" de faible affinité (éventuellement dans des mélanges) ; (ii) la connaissance des zones de contact nécessaire à la fixation du ligand et son orientation par rapport au récepteur ; (iii) proposer une synthèse orientée à partir de ces informations (iv) ceci pour trouver de nouveaux composés de plus haute affinité. Une "synthèse orientée" selon les informations obtenues par RMN et complétée par des données de "criblage virtuel orienté" devrait aboutir à la découverte et l’optimisation de molécules bio-actives de forte affinité. L’utilisation d’une approche par fragments à partir de plusieurs sites de faible affinité pour aboutir à un seul ligand de haute affinité est également envisagée. Avec la modélisation moléculaire et des techniques de "docking" développée dans l’équipe par le Docteur Nathalie EVRARD-TODESCHI, j’espère ainsi démontrer le rôle émergeant et l’apport considérable que la RMN peut apporter dans les premières étapes vers la conception de médicaments.

Thèmes de recherche

Actuellement, je poursuis des thématiques de recherche du groupe :

(1) "DNP-NMR" avec Paul VASOS pour améliorer la sensibilité et la résolution de la RMN.

(2) "Interaction peptides phosphorylés-beta-TrCP" (Collaboration avec Richard BENAROUS, Cochin, Univ. Paris Descartes) avec la recherche de composés ciblant l’activation de NF_kappa-B dans l’inflammation ou le cancer par l’inhibition de la fixation de I_kappa-B_alpha sur la beta-TrCP.

(3) "Etude structurale de peptides prion" (Collaboration avec Gaston HUI BON HOA, Hôpital Kremlin Bicêtre).

Nous abordons de nouveaux sujets tels que : (1) Le "projet intégrase" (Collaboration avec Richard BENAROUS, Cochin, Univ. Paris Descartes) avec la conception de nouvelles molécules anti-intégrase ciblant l’interaction Intégrase-LEDGF/p75" (Projet ANRS accepté le 12 janvier 2007), Guillaume BOUVIER, étudiant issu de l’Ecole Normale Supérieure de Cachan, débutera une thèse de l’école doctorale Inter///Bio en Septembre 2007 sur ce sujet sous ma co-direction avec le Professeur Jean-Pierre Girault.

(2) L’étude de la quinone réductase QR2/MT3 (Collaboration avec Jean BOUTIN, Servier, Croissy-sur-Seine) avec la société SERVIER sera très intéressante pour appliquer et valider nos méthodes RMN.

La compréhension des déterminants des surfaces d’interaction est un enjeu majeur pour la biologie structurale. Elle représente un volet important de la protéomique. Différentes sociétés privées se lancent dans l’établissement de cartes d’interactions pour des familles de protéines particulières chez l’Homme par exemple et ceci dans le but de développer de nouvelles approches pharmacologiques. La RMN peut identifier de nouvelles molécules potentiellement actives (inhibiteur d’interface protéine-protéine). Les premières molécules ligands trouvées par criblage "hits" sont rarement de forte affinité. La RMN peut tirer avantage de ces interactions faibles qui sont néanmoins spécifiques et éviter un criblage systématique. Ces informations sont primordiales et représentent un enjeu biologique majeur pour échafauder des modèles d’interaction et orienter le chimiste vers une synthèse rationnelle de ligands à visée thérapeutique. Une forme de reconnaissance concernant notre expérience de l’étude d’interactions par RMN vient de l’intérêt porté de plus en plus pour nos recherches par les industriels et par la communauté scientifique internationale.

Outre des études structurales déjà menées sur des composés d’intérêt biologique avec les équipes de l’UMR8601, je propose le développement de nouvelles méthodes de caractérisation applicables en routine. Le maintien de la RMN au laboratoire à un haut niveau passe par la mise en place des techniques les plus récentes issues de la littérature. Ces développements de RMN se font, en collaboration et au profit des équipes du laboratoire pour les études structurales de molécules d’intérêt biologique issues de synthèses chimiques ou biochimiques et de composés pharmacologiques.

Bibliographie

Articles

(1) Thématique "Prion" :

The key-role of tyrosine 155 in the mechanism of prion transconformation as highlighted by a study of sheep mutant peptides. G. Bertho, G. Bouvier, G. Hui Bon Hoa and J.-P. Girault Peptides, 2008, in press.

Structural duality of a peptide fragment from sheep prion protein : possible role of region 152-156 in conformational transition to PrPTSc. S. Megy, G. Bertho, S. A. Kozin, P. Debey, G. Hui Bon Hoa and J.-P. Girault Protein Science, 2004, 13, 3151-3160.

(2) Thématique "Résistance aux Antibiotiques" :

Antibiotic Resistance Peptides : Interaction of Peptides Conferring Macrolide and Ketolide Resistance with Staphylococcus aureus Ribosomes. Conformation of Bound Peptides by Transferred NOE Experiments. L. Verdier, J. Gharbi-Benarous, G. Bertho, P. Mauvais and J.-P. Girault Biochemistry, 2002, 41, 4218-4229.

(3) Thématique "Peptides Ligands de beta-TrCP" :

Transfer-NMR and Docking Studies Identify the Binding of the Peptide Derived from Activating Transcription Factor 4 to Protein Ubiquitin Ligase beta-TrCP. Competition STD-NMR with beta-Catenin. J. Pons, N. Evrard-Todeschi, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, V. Tanchou, R. Benarous and J.-P. Girault. Biochemistry, 2008, 47, 14-29. (Hot article)

Phosphorylation-Dependent Structure of ATF4 Peptides derived from a Human ATF4 Protein, a Member of the Family of Transcription Factors J. Pons, N. Evrard-Todeschi, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, R. Benarous and J.-P. Girault. Peptides, 2007, 28, 2253-2267.

Structural studies on 24P-I_kappa-B_alpha peptide derived from a human I_kappa-B_alpha protein-related with the inhibition of the transcription factor nuclear NF_kappa-B activity J. Pons, N. Evrard-Todeschi, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, V. Sonois, R. Benarous and J.-P. Girault. Biochemistry, 2007, 46, 2958-2972.

STD and TRNOESY NMR Studies for the Epitope Mapping of the Phosphorylation Motif of the Oncogenic Protein beta-Catenin recognized by a Selective Monoclonal Antibody S. Megy, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, F. Baleux, R. Benarous and J.-P. Girault. FEBS Lett., 2006, 580, 5411-5422.

NMR studies for identifying phosphopeptide ligands of the HIV-1 protein Vpu binding to the F-box protein beta-TrCP. N. Evrard-Todeschi, J. Gharbi-Benarous, G. Bertho, G. Coadou, S. Megy, R. Benarous and J.-P. Girault Peptides, 2006, 27, 194-210.

STD and TRNOESY NMR studies on the conformation of the oncogenic protein beta-catenin containing the phosphorylated motif DpSGXXpS bound to the beta-TrCP protein. S. Megy, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, N. Evrard-Todeschi, G. Coadou, E. Segeral, C. Iehle, E. Quemeneur, R. Benarous and J.-P. Girault. J. Biol. Chem., 2005, 32, 29107-29116.

Solution structure of a peptide derived from the oncogenic protein beta-Catenin in its phosphorylated and nonphosphorylated states. S. Megy, G. Bertho, J. Gharbi-Benarous, F. Baleux, R. Benarous and J.-P. Girault Peptides, 2005, 26, 227-241.

Epitope Mapping of the Phosphorylation Motif of the HIV-1 Protein Vpu Bound to the selective Monoclonal Antibody using TRNOESY and STD NMR Spectroscopy. G. Coadou, J. Gharbi-Benarous, S. Megy, G. Bertho, N. Evrard-Todeschi, E. Segeral, R. Benarous and J.-P. Girault Biochemistry, 2004, 43, 14555-14565.

NMR studies of the phosphorylation motif of the HIV-1 protein Vpu bound to the F-box protein beta-TrCP G. Coadou, J. Gharbi-Benarous, S. Megy, G. Bertho, N. Evrard-Todeschi, E. Segeral, R. Benarous and J.-P. Girault Biochemistry, 2003, 42, 14741-51.

 

 

 

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