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Accueil > Unités > UMR-S 1147 "Médecine Personnalisée, Pharmacogénomique, Optimisation Thérapeutique" > Anticancéreux

Anticancéreux

Anticancéreux

par Iadh MAMI - publié le , mis à jour le

Dans le cas de la maladie tumorale la variabilité génétique de la réponse thérapeutique dépend non seulement de l’hôte mais aussi de la tumeur. Nous définirons ainsi des outils pharmacogénomiques composites associant des marqueurs de l’hôte et de la tumeur qui permettront de prédire au mieux la réponse aux anticancéreux. L’emploi de thérapies dites ciblées a conduit à une caractérisation de plus en plus systématique des altérations génétiques qui pourront être utilisées comme marqueur spécifique du génome tumoral. Le développement récent dans notre laboratoire de la PCR en gouttelette et de la microfluidique permet d’envisager la détection et la quantification de ces anomalies dans différents fluides (sang, urines, selles) lesquels s’apparentent à une biopsie liquide. Par ailleurs la très grande sensibilité de cette technologie nous permettra d’appréhender un aspect jusque-là sous-estimé, celui de l’hétérogénéité intra-tumorale des altérations génétiques somatiques et d’étudier les conséquences cliniques de cette hétérogénéité sur la réponse thérapeutique. En parallèle, nous avons développé un projet d’optimisation thérapeutique par un transfert de gène modifiant le métabolisme d’une prodrogue afin d’améliorer l’efficacité et le ciblage. Les trois modèles d’études de l’ensemble de ces projets seront le cancer colorectal, le cancer pulmonaire et les cancers ORL.
Ces travaux ont pour objectifs (i) de mettre en évidence des marqueurs prédictifs de l’efficacité et de la toxicité, de les valider d’un point de vue clinique et de les amener jusqu’à une utilisation pratique, (ii) de comprendre les mécanismes moléculaires liant le marqueur à la réponse thérapeutique et le rôle de l’hétérogénéité des altérations génétiques somatiques dans les mécanismes de résistance aux thérapeutiques ciblées (iii) de développer et de valider les outils nécessaires à la caractérisation des altérations génétiques dans les différents fluides du corps humains (iv) de modifier le métabolisme des cytotoxiques pour les rendre plus efficaces et moins toxique.

Pharmacogénétique des anticancéreux

V. Boige (PH), C. Mulot (IE), P. Laurent-Puig (PU-PH), C. Pilati (Post-doctorante) et G. Perkins (Post-doctorante)
Le premier aspect de la prédiction de la réponse thérapeutique aux anticancéreux que nous allons abordé est celui de la pharmacogénétique. En effet, par l’intermédiaire de l’implication de V. Boige et de P. Laurent-Puig dans UNICANCER et la Fédération Francophone de Cancérologie Digestive (FFCD), nous avons déposé des projets ancillaires pharmacogénétiques associés à certains des essais thérapeutiques conduits par ces 2 groupes. Les bases de données de ces essais FFCD 2003-07 (NCT00374036), ACCORD-12 (NCT00227747), ACCORD-13 (NCT00423696) sont en cours de consolidation. Nous avons développé une suite de logiciels d’analyse et d’écriture de rapports d’analyse automatique (GARP : Genone wide Analysis and Reporting Pipeline) qui sera validée sur ces études pharmacogénétiques permettant la caractérisation immédiate des polymorphismes associés aux phénotypes d’intérêt (réponse, toxicité et survie). Par ailleurs nous poursuivrons l’analyse de ces données grâce à des méthodes développées au sein de l’unité faisant appel à des modèles d’apprentissage multivariés basés sur la sélection de variable par pénalisation (Silver M et al. Stat Appl Genet Mol Biol., 2012). Nous souhaitons améliorer ces modèles d’apprentissage en y incorporant les connaissances préétablies sur les regroupements possibles entre polymorphismes utilisés (ie. Regroupement par gènes, intervalles génomiques, interactions entre gènes, etc…). Des résultats préliminaires indiquent que ces développements méthodologiques permettent d’améliorer la fiabilité des prédictions établies. Plusieurs modules de visualisation seront en outre développés afin d’exploiter et de mettre en relation toutes les données disponibles sur les polymorphismes identifiés. Ainsi les réseaux d’interactions entre les gènes dont certains variants sont associés à un phénotype donné seront automatiquement établis de même que leur significativité statistique.

Identification de marqueurs prédictifs de l’efficacité et de la toxicité des anticancéreux

Comprendre la réponse aux anticorps anti-EGFRs

P. Laurent-Puig (PU-PH), V. Boige (PH), H. Blons (MCU-PH), S. Camilleri-Broët (MCU-PH), V. Taly (CR1), D. Le Corre (IE), C. Senamaud-Beaufort (AI), N. Pécuchet (Doctorant)
Depuis plus de 6 ans, nous avons développé une expertise dans la compréhension des mécanismes de résistance aux anti-EGFR dans le cancer colorectal et nous souhaitons poursuivre cette recherche (cf. bilan) dans 2 directions.
La première consiste à rechercher de nouveaux marqueurs dans la population des patients KRAS sauvages dont seulement 40% bénéficient du traitement par anti-EGFR. Nous avons mis en évidence, seuls ou en collaboration, un certain nombre de marqueurs pronostiques ou prédictifs à la fois par des approches gènes candidats et par des approches sans a priori (cf. bilan). Notre projet de recherche consiste à poursuivre ce programme en essayant de bâtir des modèles multivariés intégrant les différents marqueurs identifiés pour établir, par l’intermédiaire de nomogrammes, des outils d’aide à la décision thérapeutique permettant par exemple de calculer la probabilité de survie à 6 mois d’un patient atteint d’un cancer colorectal métastatique traité par anti-EGFR. Cette étape nous apparaît très importante pour la poursuite et le développement des innovations thérapeutiques dans le domaine de la cancérologie. Le grand nombre de molécules et leurs potentielles combinaisons, multiplient au delà du raisonnable le nombre de malades devant être inclus dans des essais thérapeutiques pour démontrer la pertinence de ces associations. L’enjeu des prochaines années est le développement de modèles prédictifs d’efficacité, la comparaison ne portant plus sur les médicaments eux-mêmes mais sur la pertinence des modèles à déterminer la meilleure combinaison thérapeutique. Dans le groupe des malades ayant un cancer du colon métastatique KRAS sauvage, nous avons récemment mis en évidence une association entre la surexpression du microARN hsa-mir31-3p dans des cellules tumorales et une résistance aux anticorps anti-EGFR. Cette association a été confirmée dans 2 séries indépendantes de malades traités de façon similaires. Nous allons d’une part valider la nature prédictive de la surexpression de ce microARN en comparant une série de patients traités par une association de chimiothérapie cytotoxique classique et d’un anti-EGFR à une série de patients traités uniquement par chimiothérapie. Des contacts ont été pris auprès de Merck-Serono et d’Amgen afin d’avoir accès à des collections d’échantillons collectés dans le cadre d’essais de phase II et III. D’autre part, nous souhaitons comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance induite par ce microARN. Pour cela nous étudierons les modifications transcriptomiques induites par la surexpression ou par l’inhibition de ce microARN.
La seconde direction de notre projet de recherche consiste à caractériser de manière la plus complète possible les tumeurs de patients répondeurs et non-répondeurs en sélectionnant des patients avec les phénotypes les plus tranchés (répondeur complet et long survivant versus les patients progressifs à la première évaluation, et à survie courte). Les développements technologiques récents (séquençage systématique de type exomique ou séquençage de l’ARN) et la diminution des coûts de leur réalisation nous permettent d’avoir de manière relativement simple une vue d’ensemble des altérations génétiques des tumeurs (CNV, amplification, translocation, expression génique). De plus cette caractérisation moléculaire systématique des tumeurs nous permet de nous intéresser à une nouvelle dimension, celle de l’hétérogénéité génétique des cellules tumorales. Des publications récentes ont souligné l’importance de ce phénomène (Longo et al. N Engl J Med, 2012). Dans un travail préliminaire (Benhaim et al. J Clin Oncol, 2011 Lettre) nous avons montré qu’en augmentant la sensibilité des méthodes, le taux de détection des mutations KRAS augmentait. La caractérisation de la réponse initiale au traitement et le devenir de ces malades sont peu connus. Des résultats récents (Misale et al. Nature, 2012) suggèrent un intérêt clinique potentiel de la détection de ces sous-clones mutant dont la quantification est probablement importante. Nous proposons, dans notre série de patients dont la tumeur a été génotypée « triple sauvage » (KRAS, NRAS et BRAF non mutés), d’identifier et de quantifier les sous clones minoritaires (KRAS, NRAS, ou BRAF mutés) et de corréler leur présence avec la réponse et la survie de ces malades traités par anti-EGFR. Cette approche sera développée par des techniques de PCR en gouttelette (V. Taly) selon une méthodologie identique à celle développée dans le projet « développement de marqueurs de suivi de la maladie tumorale » (cf. § infra). Un article récent en collaboration avec A. Griffiths (Strasbourg) a montré que nous pouvions atteindre une sensibilité de détection d’une copie mutée pour 200 000 copies sauvages (Perkin et al. Lab on Chip, 2011). Nous disposons de l’ADN tumoral de plus de 175 malades traités par des anticorps antiEGFR dont la tumeur est « triple sauvage », grâce auquel nous identifierons et quantifierons la présence de sous-clones mutés minoritaires (KRAS, NRAS et BRAF). Un des résultats possible de cette étude est la définition de seuils pour lesquels la présence de sous clones mutés serait liée à un événement de résistance ou à une survie plus courte en raison de la sélection de ce sous clone par les anticorps anti-EGFR.
Pour l’ensemble de ces projets nous disposons au sein du laboratoire de collections prospectives de malades : protocole CETRAS (n=250 malades ; CPP Ile de France n°2 2007-03-01 2007-A00124-49) ; PIMABI-GERCOR (n=64 ; EudracCT Number : 2007-004806-28). Par ailleurs, nous disposons des prélèvements sanguins et tumoraux correspondants à 2450 malades atteints de cancer colorectal inclus dans un projet pan européen PETACC08-FFCD traités par anticorps anti-EGFR en situation adjuvante.

Comprendre la réponse aux Inhibiteurs des récepteurs à activité Tyrosine Kinase (ITK)

  • Rôle des Cytochromes P450 dans le métabolisme des inhibiteurs

C. Narjoz (PH), I. de Waziers (CR1), P. Beaune (PU-PH), collaborations : B. Rochat (Lausanne), G. Kroemer (INSERM U848)
Pour pouvoir mieux prédire la réponse aux ITK il est nécessaire de connaître le métabolisme et le mécanisme d’action de ces médicaments. Nous avons donc deux projets l’un portant sur le métabolisme de 5 ITK, l’autre sur la cytotoxicité induite par ces ITKs :
• une étude in vitro et ex vivo sur le métabolisme de l’imatinib, du dasatinib, du sunitinib, du sorafenib et du nilotinib par des cytochromes P450 (CYP1A1, CYP3A4, CYP1B1, CYP2J2) surexprimés dans des lignées tumorales sera réalisée en collaboration avec le Dr B. Rochat (Université de Lausanne). Nous réalisons au laboratoire les expérimentations ex vivo sur les lignées cellulaires et l’analyse des métabolites sera effectuée par le Dr B. Rochat. Des résultats préliminaires ont été obtenus sur les métabolites produits et les P450 impliqués dans le métabolisme de ces ITK.
• la cytotoxicité des ITK est étudiée en collaboration avec le Pr G. Kroemer afin d’identifier ceux pouvant induire une mort cellulaire immunogénique. Une série de 9 ITK a été analysée par une technique de microscopie à haut débit qui recherche l’apparition de marqueurs de stress du réticulum, d’autophagie et d’immunogénicité. Des résultats préliminaires indiquent que 2 de ces 9 ITK induisent une mort immunogénique. Ils seront étudiés plus en détails en relation avec leur métabolisme. Nous espérons ainsi mettre en évidence des marqueurs prédictifs d’une réponse à ces deux molécules.

  • Rôle de la transition épithélio-mésenchymateuse dans la réponse aux inhibiteurs de tyrosine kinase

H. Blons (MCU-PH), E. Fabre (PH), S. Camilleri-Broët (MCU-PH), A. Legras (Doctorant), AI sur contrat

Nous avons montré l’impact de la réactivation du facteur de transcription embryonnaire TWIST1 sur la survenue de modifications phénotypiques de type Transition Epithélio-Mésenchymateuse (TEM) in vitro et in vivo dans une série de adénocarcinomes pulmonaires localisées. Nos résultats (Pallier et al. PlosOne 2012, cf bilan), nous ont conduits à envisager une validation de l’impact de la réactivation de TWIST1 dans une autre série d’adénocarcinomes pulmonaires métastatiques EGFR mutés et traités par erlotinib ou gefitinib (ITK anti-EGFR). Ce travail est réalisé dans le cadre d’une collaboration avec le Pr Hofman (Nice) et le Dr Beau-Faller (Strasbourg). Les objectifs sont triples : (i) valider l’existence d’une réactivation de TWIST1 dans un sous groupe de tumeurs EGFR mutées, (ii) analyser le rôle de cette réactivation sur l’expression des marqueurs épithéliaux et mésenchymateux et (iii) mesurer l’impact de cette réactivation sur la réponse à ces ITK et sur la survie. Les marqueurs de la TEM seront analysés par RT-qPCR (TWIST1, CDH1, JUP, CDH2, VIM, SNAIL1 et SLUG). Nous effectuerons également une étude de l’expression du facteur de transcription TWIST1 et du marqueur épithélial CDH1 par immunohistochimie.
Dans les tumeurs du poumon, la survenue d’une TEM est une cause identifiée de résistance aux ITK anti-EGFR sans que les évènements moléculaires ou cellulaires n’aient été à ce jour décrits. Une de nos hypothèses est que la réactivation de TWIST1 soit l’un des acteurs principaux du déclenchement d’une TEM dans les cellules EGFR mutées et qu’il puisse conduire à la survenue d’une résistance à ces traitements. Afin de mieux comprendre les interactions entre l’activation de la voie de l’EGFR, TWIST1, le phénotype cellulaire et la réponse au traitement, nous poursuivrons la part expérimentale in vitro de notre étude selon deux axes :
1/ l’impact de la réactivation de TWIST1 dans des cellules mutées pour le récepteur à l’EGF sur la réponse aux ITKs sera étudié. Pour ce faire, nous utiliserons un vecteur lentiviral d’expression de TWIST1 (collaboration avec le Pr A. Puisieux, Lyon) afin d’infecter les cellules de tumeur pulmonaire HCC827 qui présentent à l’état basal une mutation activatrice de l’EGFR (délétion partielle en phase au sein de l’exon 19) sans réactivation de TWIST1. La lignée générée servira de base à l’étude de la sensibilité in vitro par comparaison à la lignée parentale et d’autres lignées EGFR mutée avec ou sans réactivation de TWIST1. Par ailleurs l’impact de la réactivation de TWIST1 sur le transcriptome et le profil microARN des cellules HCC827-TWIST1 sera analysé par comparaison à la lignée HCC827 afin de générer des hypothèses quand aux modifications moléculaires engendrées par cette réactivation qui pourront être secondairement validées sur des tumeurs de patients (collaborations biobanques Nice et Strasbourg).
2/ les liens de coopération oncogénique entre un récepteur de l’EGF activé par mutation et TWIST1 passant par les voies de régulation de l’inflammation seront étudiés. En effet un article récent a montré que la présence de cytokines pro-inflammatoires au sein du microenvironnement tumoral pouvait réactiver TWIST1 et conduire à une TEM via la voie de NFkB (Li et al. Cancer Res 2012). Si cette hypothèse est validée dans les tumeurs pulmonaires, ces voies de signalisation constitueraient une cible thérapeutique potentielle.
Par ailleurs notre unité est partenaire du projet TEMIE « Transition épithélio-mesenchymateuse dans les cancers bronchiques non à petites cellules » coordonné par le Dr Beau-Faller et financé dans le cadre des projets Emergence du Cancéropole du Grand-Est. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer les marqueurs de TEM dans 2 séries prospectives de patients IFCT-0002 (patients opérés traités par chimiothérapie péri-opératoire à base de sels de platine) et l’étude observationelle ERMETIC (patients traités par ITK anti-EGFR indépendamment de leur statut EGFR) nous permettant de tester l’impact de la réactivation de TWIST1 sur une population de patients dont la tumeur n’est pas mutée pour l’EGFR.

Simulation de la résistance aux thérapies ciblées en microfluidique

V. Taly (CR1), P. Nizard (IR), O. Caen (Doctorant), H. LU (Doctorant), E. Zonta (Post-doctorante)

Si les thérapies ciblées ont amélioré le pronostic des patients atteints de cancer, la survenue d’une résistance est quasi constante. Dans un certain nombre de cas, elle est liée à de nouvelles mutations sur les gènes cibles ou appartenant aux voies de signalisation associées. L’apparition de clones résistants est un problème majeur en oncologie (Sawyers et al. Nature, 2008). L’origine de ces clones résistants peut être due à une sélection d’une sous population préexistante soit à l’acquisition de nouvelles mutations. En s’inspirant des nombreux exemples d’évolution dirigée in vitro de nouvelles protéines, nous devrions pouvoir recréer ces processus dans des lignées tumorales. Le but est de développer une nouvelle approche permettant l’identification rapide de nouveaux marqueurs de résistance à une thérapie donnée, sans aucun a priori quant aux altérations génétiques impliquées. Différentes puces microfluidiques seront élaborées, chacune pouvant donner des informations pertinentes et complémentaires sur les processus d’acquisition de résistance. Nous prendrons pour modèle l’acquisition de résistance des adénocarcinomes pulmonaires aux ITK de l’EGFR, principalement causé par la mutation p.T790M. Ce choix est justifié par des travaux récents qui ont démontré qu’en exposant des lignées sensibles à des concentrations croissantes de Gefitinib pour une durée de 6 mois, des clones portant la mutation p.T790M EGFR (lignées PC9 ou H3255) (Turke et al. Oncogene 2010) et/ou des amplifications du gène c-MET (lignées HCC827) pouvaient être sélectionnés (Engelman et al. Science 2007). Les modules qui constitueront la première génération de puces microfluidiques, ont été développés et optimisés par des étudiants encadrés par V. Taly et/ou par JC. Baret (collaborateur sur ce projet). L’intégration de tels modules a déjà démontré la possibilité de cribler de larges banques contenant un très faible nombre de variants d’intérêt (Baret et al. Lab on Chip, 2009). Des travaux récents ont démontré que différents types cellulaires pouvaient être encapsulés et incubés plusieurs jours sans effet délétère sur leur viabilité. Un des avantages de nos approches pour le criblage cellulaire repose sur le fait qu’il permet l’étude d’un très grand nombre de cellules uniques en parallèle plutôt que de populations cellulaires comme dans le cas de culture en volume classique (Baret et al. Chem Biol, 2010). Le criblage haut-débit de cellules uniques permet de détecter la variabilité de réponse avec une sensibilité supérieure. Les puces microfluidiques seront utilisées comme un système de sélection extrêmement contrôlé dans lequel la réponse de chaque cellule de la population tumorale peut être mesurée et les seuils de sélection modulés.
Notre première puce sera développée et validée en utilisant un mélange de deux types de cellules : une lignée sensible (PC9 ou H3255) et une lignée résistante (H1975) portant la mutation p.T790M. Les cellules seront encapsulées individuellement en présence de quantités croissantes d’inhibiteur. Après incubation, les gouttes seront testées grâce à un test de survie cellulaire injecté au sein des gouttes (Brouzes et al. PNAS, 2009). Après chaque cycle, les cellules résistantes seront ensuite soumises à un nouveau cycle d’évolution ou caractérisées pour la présence de la mutation p.T790M. Après cette première étape, nous appliquerons notre stratégie à différents lignées sensibles et les clones résistants seront caractérisés initialement par séquençage ciblé de gènes spécifiques tels que le gène codant pour l’EGFR ou c-MET. En raison du grand nombre de cellules qui peuvent être criblées (le tri des cellules sera réalisé avec une fréquence allant de 500 à 1000 gouttes par seconde) nous pensons voir l’apparition des altérations génétiques dans des délais très courts (nous avons déjà démontré la possibilité de trier une seule gouttelette au sein d’une population de plusieurs milliers de gouttelettes).
L’étape suivante sera de valider notre puce microfluidique pour l’étude de l’effet d’autres traitements pour lesquels des mutations responsables d’acquisition de résistance ont été identifiées (par exemple le Crizotinib pour le traitement du cancer du poumon).
Par ailleurs, les tumeurs sont des tissus hétérogènes contenant des cellules cancéreuses qui interagissent avec des cellules normales, au sein du microenvironnement tissulaire. Ces interactions, constituent une forme de commensalisme : il a été démontré que ces cellules non malignes supportaient et même permettaient la croissance tumorale. Ainsi, la coopération pourrait jouer un rôle important dans les phénomènes d’acquisition de résistance au sein des populations de cellules tumorales. Des travaux récents du laboratoire ont montré qu’en jouant sur les stratégies d’incubation, l’échange de petites molécules entre les gouttelettes pourrait être modulé (Skhiri et al. Soft Matter, 2012). Par conséquent, en contrôlant ces échanges et en augmentant le nombre de cellules par gouttelettes, nous pourrions comprendre le rôle de la coopération dans l’acquisition des résistances.
Ces puces microfluidiques représenteront un outil puissant pour comprendre et prédire la résistance à des traitements ciblés avant leur mise en évidence sur des patients. En effet, être capable de prédire une altération génétique associée à la résistance à un traitement ciblé avant sa mise en évidence clinique permettrait le développement en amont des combinaisons thérapeutiques les plus efficaces.

Suivi de la réponse thérapeutique

H. Blons (MCU-PH), V. Taly (CR1), E. Fabre (PH), A. Zaanan (CCA), Unité de recherche Clinique de l’Hôpital européen Georges Pompidou, P. Laurent-Puig (PU-PH), P. Nizard (IR), F. Garlan (Doctorante) C. Perez Toralla (Post-doctorante), E. Zonta (Post-doctorante), JF. Bartolo (Post-doctorant), S. Garrigou (IE), C. Normand (IE)

L’identification systématique des altérations génétiques des tumeurs dans le but de définir la meilleure approche thérapeutique, nous donne accès à un marqueur spécifique des cellules tumorales. Il permet de mettre en évidence la présence de l’ADN tumoral circulant dans les fluides biologiques de malades atteints de cancer (Lecomte et al. Gastroenterol Clin Biol, 2012 revue). L’utilisation clinique de ce marqueur est restée limitée du fait de difficultés techniques liées à un manque de sensibilité de la détection d’allèles minoritaires et de leur validation dans le cadre du diagnostic.
Cette thématique est développée depuis 2005 au sein de notre unité et nous avons établi une collection de prélèvements provenant de patient atteints d’un cancer colorectal de stade II ou III depuis 2007 dans le cadre d’un PHRC NCT01198743 (Investigateur principal P. Laurent-Puig) où 220 patients ont été inclus (inclusions attendues 250). L’ADN de la tumeur de ces patients a été conservé et caractérisé pour la recherche de mutations des gènes KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA, APC, FBXW7 et TP53. 4 ml de plasma ont été prélevés à J0, J5 et tous les 4 à 6 mois pendant 3 ans. Plus de 1500 échantillons de plasma ont été prélevés. Un suivi de 5 ans permettra de connaître l’évolution de ces patients. L’ADN du plasma a été extrait et sera caractérisé pour l’une des mutations de la tumeur, témoignant ainsi de la présence d’ADN tumoral circulant. L’objectif de ce travail est de mesurer l’impact pronostique de la présence d’ADN tumoral circulant au moment du diagnostic et d’évaluer le potentiel de cette détection dans le diagnostic précoce de la récidive. Après avoir développé des techniques de discrimination allélique par PCR en tube (Didelot et al. J Mol Diag, 2012), nous avons voulu augmenter la sensibilité de détection des allèles mutés et mesurer leur quantité absolue dans le plasma des malades. L’arrivée de V. Taly dans l’unité nous permet une progression dans ce domaine grâce à la technologie de la PCR en gouttelettes. Elle permet de réaliser des millions de PCR en parallèle dans des gouttelettes contenant au plus une molécule d’ADN pour détecter et quantifier des séquences mutées efficacement même en présence d’un large excès d’une séquence non mutée (figure 2) . Cette méthode a été appliquée à la détection des 7 mutations les plus fréquentes de l’oncogène KRAS à partir d’ADN de lignées cellulaires tumorales. En combinant au sein d’une même gouttelette une sonde ciblant la séquence sauvage et une sonde ciblant une séquence mutante nous pouvons déterminer la proportion de séquences mutantes en comptant les gouttes présentant un signal correspondant à l’une ou l’autre des séquences testées. Cette technologie permet la mise en évidence d’un ADN muté au sein de 200 000 séquences sauvages ce qui correspond à une augmentation de la sensibilité de détection de l’ordre de 2 log par rapport à la PCR en tube. La dynamique de détection est linéaire sur au moins 4 log (Pekin et al. Lab On Chip, 2011). Nous avons grâce à notre collection de malades la possibilité de démontrer l’intérêt potentiel clinique du suivi des malades selon les critères reconnus de validation des marqueurs (REMARK ; Altman et al. PlosOne, 2012). Pour un développement industriel nous collaborons avec la société Raindance technologies.
Plusieurs nouvelles cohortes de patients sont en cours de constitution en particulier des patients atteints de cancers pulmonaires, ovariens et colorectaux métastatiques et traités par diverses chimiothérapies afin d’étudier l’impact des variations de quantité de l’ADN tumoral plasmatique sur la prédiction de l’évolution de la maladie et de la réponse au traitement. La mise en évidence d’une association entre la cinétique de variation de l’ADN tumoral circulant et les paramètres cliniques permettrait d’adapter précocement la stratégie thérapeutique. A titre d’exemple, nous développerons le projet concernant le cancer pulmonaire. En effet, la prise en charge des cancers pulmonaires métastatiques passe aujourd’hui par un typage moléculaire du tissu tumoral afin d’individualiser la prise en charge thérapeutique, ainsi près de 40% des échantillons tumoraux seront identifiés par l’existence d’une mutation oncogénique qui sera le marqueur d’ADN tumoral circulant. Le suivi de la réponse tumorale sous traitement doit pouvoir être évalué de façon la moins invasive possible dans cette population de patients souvent fragile. Notre premier objectif est de valider la possibilité de quantifier l’ADN circulant à différents temps du suivi des patients et d’identifier dans le sous-groupe de patients dont la tumeur est génétiquement caractérisée l’altération moléculaire dans l’ADN circulant. Une quantification des rapports alléliques mutant/sauvage sera réalisée à l’aide des techniques de PCR en gouttelettes (cf. supra). Pour les patients dont la tumeur ne présente pas d’altération génétique, celle-ci pourra être caractérisée dans un deuxième temps à la recherche de mutations rares (Ion Torrent) et la recherche d’ADN tumoral circulant pourra alors être entreprise. Les résultats attendus doivent nous permettre : (i) de montrer la faisabilité d’une telle démarche en situation diagnostique, (ii) de corréler la présence d’ADN tumoral circulant aux paramètres cliniques (masse tumorale, stade, caractère invasif, survie, réponse au traitement), (iii) d’étudier l’impact de ces nouveaux marqueurs dans le suivi thérapeutique. De plus, dans le sous-groupe des patients traités par ITK dont la tumeur est EGFR muté, nous rechercherons l’émergence d’altérations génétiques secondaires. En effet, l’acquisition d’une résistance est fréquemment associée à de nouvelles altérations génétiques sélectionnées par le traitement. Nous prévoyons de rechercher la mutation p.T790M de l’EGFR sur le prélèvement de plasma au moment de la rechute clinique du patient. Cette altération est décrite comme responsable de 50% des rechutes aux ITK anti-EGFR.

Nouvelles approches thérapeutiques

  • Sensibiliation des cellules tumorales aux anti-cancéreux par transfert d’un gène "suicide"

I. de Waziers (CR1), P. Beaune (PU-PH), C. Narjoz (AHU), I. Amara (Doctorante), C. Senamaud-Beaufort (IE), A. Devilliers (IE). Collaborations avec F. Lemoine CNRS UMR 7087, E. Tartour HEGP, J. Seguin et M. Bureau, UPCGI, UMR8151 CNRS/U1022 INSERM, C. Badoual HEGP, service d’anatomo-pathologie
Dans le cadre de notre projet GDEPT (cf. bilan), nous avons produit un lentivirus recombinant exprimant un gène « suicide » (LV-2B6TM-RED) capable de métaboliser très efficacement un anticancéreux, le cyclophosphamide (CPA) en métabolites cytotoxiques. Nous avons montré ex vivo et in vivo que l’expression de ce transgène dans les cellules tumorales (poumon, ORL) les sensibilisait au CPA entraînant une mort des cellules tumorales et une disparition des tumeurs. Enfin, il semble que l’effet cytotoxique du CPA déclenche une réponse immunitaire dirigée contre les cellules tumorales optimisant ainsi notre stratégie.
Notre but est, in fine, d’appliquer cette stratégie en thérapeutique clinique ; il est donc nécessaire, au préalable, d’en préciser les mécanismes d’action et d’en optimiser les protocoles d’utilisation. Pour ce faire, nous développerons les projets suivants : (i) tester notre stratégie in vivo dans différents modèles animaux et caractériser la réponse immunitaire induite, (ii) améliorer le ciblage des cellules tumorales, (iii) tester l’association d’autres prodrogues susceptibles d’être transformées en métabolites cytotoxiques par le CYP2B6 ou par la RED, (iv) associer notre stratégie à des thérapies vaccinales.

  • Tester notre stratégie in vivo dans différents modèles animaux et caractériser l’éventuelle réponse immunitaire. Pour mimer l’efficacité partielle de l’infection par les lentivirus, nous testerons l’efficacité de notre stratégie sur des tumeurs comprenant 25% de cellules TC1-Luc2-CYP2B6TM-RED et 75% de cellules TC1-Luc2 ; nous vérifierons ainsi, in vivo, l’existence de l’effet « bystande »r observé ex vivo. Si nous observons une disparition des tumeurs, des essais de réinjection de cellules TC1-Luc2 seront également programmés pour confirmer l’implication du système immunitaire dans l’efficacité de notre stratégie. Puis, à l’image de ce qui pourrait être proposé en clinique, en collaboration avec le Dr F. Lemoine (CNRS UMR 7087), dans une animalerie permettant l’utilisation de lentivirus recombinants, nous testerons notre stratégie en injectant le lentivirus LV-CYP2B6TM-RED dans des tumeurs sous-cutanées de cellules TC1-Luc2 puis en traitant les animaux par du CPA en i.p. Nous optimiserons ainsi les modalités d’injection du lentivirus recombinant et nous rechercherons son éventuelle dissémination dans les tissus sains avoisinants (immunohistochimie, qRT-PCR). Nous suivrons également dans le sang des souris les différentes populations de lymphocytes T (CD4, CD8 et T-regs). Si les traitements s’avèrent efficaces nous réinjecterons des cellules TC1-Luc2 et nous caractériserons les réponses immunitaires observées (cellulaires et /ou humorales). Enfin, la mort immunogénique induite par des chimothérapies cytotoxiques est caractérisée par différents facteurs (translocations précoces de protéines chaperonnes comme la calréticuline, libération du facteur nucléaire High Mobility Group Box 1 (HMGB1), la libération d’ATP par les cellules mourantes) (Obeid, Nat Med, 2007, Apetoh, Immunol Rev, 2007, Ghiringhelli, Nat Med, 2009). Nous vérifierons donc ex vivo si ces paramètres sont modifiés sur des cellules exprimant notre gène « suicide », après traitement au CPA.
  • Améliorer le ciblage des cellules tumorales. Dans tous ces modèles, la biodistribution du transgène dans la tumeur, les tissus avoisinant la tumeur et dans les organes à distance sera évaluée par immunohistochimie, grâce aux anticorps spécifiques anti-CYP2B6 et anti-RED. Nous envisageons également dans nos constructions CYP2B6TM-RED d’insérer des séquences de miRNA, non exprimées dans les tumeurs mais exprimées dans les tissus non tumoraux pour empêcher leur expression dans d’autres cellules que les cellules tumorales (Touati et al. 2011, revue). J. Bouchama (stagiaire M2, 2012) a identifié un miRNA (mir-142) non-exprimé dans des lignées pulmonaires humaines et a montré que l’insertion de la séquence cible (miR142T) du mir-142, en aval d’un gène rapporteur permet l’extinction de ce gène rapporteur en présence de mir-142. Ces résultats encourageants devraient nous conduire à insérer des séquences cibles de miRNA en aval de notre transgène quand nous aurons vérifié que ce miRNA n’est pas exprimé dans des biopsies de tumeurs humaines (fournies par le Dr C. Badoual, HEGP) ciblées par notre stratégie. De plus, nous rechercherons d’autres miRNA ayant des propriétés similaires. iii) Tester l’association d’autres prodrogues métabolisées par le CYP2B6 ou la RED. Dans notre stratégie GDEPT, nous exprimons une protéine de fusion catalysant les activités enzymatiques du CYP2B6 et de la réductase. Nous nous proposons d’améliorer l’efficacité du traitement au CPA, en administrant conjointement d’autres prodrogues susceptibles d’être activées en métabolites cytotoxiques par le CYP2B6 ou par la RED. Il a été montré que, dans des tumeurs xénogreffées (fibrosarcome murin) transfectées avec du CYP2B6, l’efficacité du CPA, en terme de régression tumorale, était augmentée par l’administration concomitante d’AQ4N (Banoxantrone) qui est une prodrogue non toxique, activée dans les cellules en hypoxie, par plusieurs CYPs, dont le CYP2B6 (McErlane et al. J Gene Med, 2005). De plus, chez des souris xénogreffées avec des lignées tumorales de cancer du sein, la mitomycine C (MMC) n’a aucun effet mais l’infection des tumeurs avec un virus exprimant la RED rend 51 % des tumeurs sensibles au traitement (Cowen et al. Mol Cancer Ther, 2003). Enfin, la tyrapazamine (TPZ) est une prodrogue qui est bioactivée, en conditions hypoxiques, en métabolites cytotoxiques qui induisent des cassures dans l’ADN (Yang et al. Cancer Res, 2003). La RED joue un rôle majeur dans cette activation et il a été montré in vitro et in vivo que la surexpression de la RED rendait les cellules tumorales sensibles à la TPZ (Jounaidi et al. Cancer Res, 2000). Tous ces traitements n’étant efficaces qu’en conditions hypoxiques, retrouvées dans la majorité des tumeurs solides humaines (Brown et al. Cancer Res, 1998), l’efficacité de l’association de ces différentes thérapies sera testée, ex vivo, sur les lignées cultivées en hypoxie (Anaerocult, Merck), puis, selon les résultats obtenus, sur des modèles animaux. iv) Associer notre stratégie à des thérapies vaccinales. Notre projet nous a conduit à développer des collaborations avec les laboratoires d’E. Tartour (HEGP) et de F. Lemoine (CNRS UMR 7087) qui développent des vaccins dirigés, entre autres, contre les protéines de Papilloma virus connues pour être exprimées dans de nombreuses tumeurs humaines (Si-Mohamed et al. J Clin Virol, 2012). Les cellules TC1-Luc2 que nous avons utilisées dans nos modèles animaux expriment des protéines de papilloma virus et sont utilisées par ces deux laboratoires pour développer de nouveaux vaccins. Le cyclophosphamide est connu pour diminuer la quantité de lymphocytes T-regs et améliorer la réponse aux vaccins (Barbon et al. Cellular Immunology, 2010). Nous avons effectivement observé, dans le sang des souris traitées au CPA à 140 mg/Kg, une diminution significative des T-regs. Nous nous proposons donc, dans nos modèles animaux, d’associer notre stratégie GDEPT à des thérapies vaccinales, en collaboration avec ces deux laboratoires. Les résultats et projets présentés ouvrent des perspectives d’amélioration de la chimiothérapie des tumeurs solides humaines relativement insensibles aux traitements chimiothérapeutiques actuels et accessibles à un traitement par un vecteur viral. Ces progrès porteraient à la fois sur un meilleur ciblage de la tumeur, une augmentation de l’efficacité du traitement et à une diminution des effets secondaires de la chimiothérapie

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